温敏性高分子修饰到微米纤维上用于细胞分离

BCML速递 2020-11-21 10:49:26

再生医学被认为是一个很有发展前景的领域,特别是基于细胞移植的再生医学。对于那些不能用化学合成药物治疗的病人,将细胞移植到体内的治疗方法变得更加适用。为了提高移植效率,近年来,各种技术被研究使用,包括细胞悬液直接注射、使用生物可降解支架的细胞组织移植和细胞片技术。使用聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)制备温敏型培养皿获得的细胞片,因为很好的保留了细胞间的连接和表面蛋白,相比较其他方法更适用于临床医学。然而,使用PIPAAm改性玻璃板表面或者聚苯乙烯(PS)培养皿表面都只能有限的在表面进行细胞分离,而用于制造移植治疗的大三维组织需要大量细胞分离。

因此,日本东京女子医科大学Teruo Okano 教授团队、Kenichi Nagase教授团队以及早稻田大学Naoya Takeda教授团队合作,通过静电纺丝技术制备对氯甲基苯乙烯 (PVBC)微米纤维,再通过原子转移自由基聚合方法将PIPAAm接枝到纤维上(Fig. 1)。探究正常人皮肤成纤维细胞(NHDF),人脐静脉内皮细胞(HUVEC),脂肪干细胞(ADSC),以及微血管内皮细胞(HMVEC)在PIPAAm修饰后的微米纤维上的粘附和脱附性能。最终结果表明,PIPAAm改性的微米纤维可作为温度调控细胞分离材料用于分离细胞。

Fig.1. Schematic of thermoresponsive microfiber preparation via electrospinning and surface-initiated ATRP. (A) Electrospinning of PVBC microfibers, (B) PIPAAm grafting on PVBC microfibers.

研究者通过将PVBC溶于不同混合比例的二氯甲烷与DMF混合溶剂,通过静电纺丝技术,制备得到6种不同直径的微米纤维(A:1.01 μm,B: 3.10 μm,C:5.12 μm,D:9.85 μm,E:15.6 μm,F:20.0 μm)(Fig. 2)。

Fig. 2. SEM images of PVBC microfibers fabricated by electrospinning. Scale bar: 20 mm. All images were taken with 500 magnification.

在Fig. 2中,不同直径纤维SEM图所示,随着纤维直径的增大,纤维间的距离也在增大。在小直径微米纤维中,细胞难进入纤维内部,一个细胞会贴附到多个纤维,为细胞提供了多个粘附位点。在大直径微米纤维中,纤维间隙也更大,每个细胞只粘附在一根纤维上,在这种情况下,纤维直径不影响细胞的粘附和脱附,并且细胞可以进入纤维膜内部,可以更大量的分离细胞。因此,研究人员选择更大直径的F组进行PIPAAm接枝处理。

在对F组大直径纤维进行PIPAAm修饰中,研究人员通过控制不同反应单体浓度(250 mM, 500 mM, 1000 mM),制备不同PIPAAm接枝量修饰的微纤维(由于1000 mM浓度下PIPAAm接枝量太大,测量其分子量时超出量程,因此不做此分组)。实验设计成3组:250 mM 500 mM浓度下制备的FVI-250FVI-500以及未接枝处理的PVBC,分别用于NHDF HUVEC细胞的粘附和分离测试。在不同温度下的细胞荧光照片和吸附率分别如Fig. 3Fig. 4所示

Fig. 3. Cell morphologies on PIPAAm-brush modified microfibers imaged with fluorescent microscopy. Red,F-actin; blue, nuclei. (A) FVI-250, (B) FVI-500, and (C) PVBC fibers. Upper lines, NHDF; Bottom lines, HUVEC. Scale bar: 100 mm.

Fig. 4. Adhesion ratios between NHDF and HUVEC on PIPAAm-brush modified microfibers for two different incubation protocols. Gray bars, NHDF; open bars, HUVEC. (A) FVI-250, (B) FVI-500, and (C) PVBC fibers. (*P < 0.05; n = 3.)

FVI-500组长链、高接枝量的PIPAAm修饰组,不利于细胞贴附。短链的PIPAAm修饰的FVI-250组相比较FVI-500组表现更利于细胞贴附,并且FVI-250组温度变化后,对NHDF细胞比HUVEC细胞有更好细胞分离效果。选择FVI-250组,分别在37和20条件下电镜观察细胞在微米纤维上的形态(Fig. 5)。

Fig. 5. SEM images of NHDFs and HUVECs on FVI-250. Scale bar: 20 mm

Fig. 5结果显示,NHDF细胞和HUVEC细胞在37条件下,在纤维上的细胞形态表现出对纤维粘附强度差异,Fig. 4结果也同时验证了这一结论。在FVI-250组微米纤维中,NHDF细胞和HUVEC细胞表现出的不同粘附行为说明这个微米纤维可以用于细胞分离。

因此,对HUVEC细胞和NHDF细胞混合接种在FVI-250组微米纤维中检验它们是否可以分离(Fig. 6)。

Fig. 6. Adhesion and detachment profiles of NHDF and HUVEC co-cultured on FVI- 250. (A) Cell morphology on FVI-250. GFP-NHDFs and RFP-HUVECs were observed with a fluorescent microscope as green and red, respectively. Scale bar: 100 mm. (B) Cell adhesion ratio on FVI-250 (*P < 0.05; n = 3). (C) Percentages of the non-adhered cells regarded as recoverable cells. (D) Estimated compositions of cell species in the collected specimens by separating the thermoresponsive microfiber mat. 

NHDF细胞和HUVEC细胞分别使用荧光显微镜鉴定培养过程中细胞形态随温度的变化。共培养细胞粘附性与个体细胞培养相似。在37,NHDF细胞粘附达72.3 %,大于HUVEC细胞的28.3 %。在20孵育后后,NHDF细胞脱离微米纤维,附着细胞的比例显著下降到27.5 %。在共培养的每个温度阶段,不粘细胞都可以从微米纤维中回收。HUVEC细胞可以在37共培养时获得72.1 %的不粘附细胞,而NHDF细胞达83.9 %的不粘附细胞可以在20孵化后得到。因此,FVI-250微米纤维可以通过控制温度分离这些细胞。

 

本研究由日本东京女子医科大学Teruo Okano 教授团队、Kenichi Nagase教授团队以及早稻田大学Naoya Takeda教授团队合作完成,于2017年2月17日发表在Acta Biomaterialia。

 

论文信息:

Kenichi Nagase*, Yoichi Sakurada, Satoru Onizuka, Takanori Iwata, Masayuki Yamato, Naoya Takeda*, Teruo Okano*. Thermoresponsive polymer-modified microfibers for cell separations. Acta Biomaterialia. 2017;53:81–92

 

论文链接:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1742706117301381


作者 王根

审校 朱彩虹

编辑 王根



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