薄层色谱法(TLC)原理及技术

TUST微生态调控与分子药理研究室 2020-04-06 04:16:53

一、简介

   1.定义:薄层色谱法(Thin Layer Chromatography,TLC)通常指以吸附剂为固定相的一种液相色谱法。即将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的表面上均匀地铺成薄层,试样点在薄层的一端,流动相借毛细作用流经固定相,使被分离的物质展开。

    2.原理薄层色谱是吸附色谱,展开过程中,组分在两相之间发生多次吸附-解吸附平衡,吸附牢的组分随展开剂移动慢,吸附弱的组分随展开剂移动快,一段时间后,组分被分离,各组分在薄层板上形成不同距离的斑点。

    3.特点:

    1)与纸层析和纸层析比较TLC快速、分离效率高、灵敏度高、显色方法多样、图像易保存;

    2)与液相色谱的比较

    4.应用:薄层色谱是化学的一种分离和分析方法,可用于:

    a.定性鉴别;

    b.药品的质量控制和杂质检查;

    c.化学反应进程的控制;

    d.柱色谱分离条件的探索。


二、基本参数

1.比移值Rf=原点至组分点中心的距离/原点至流动前沿的距离。如图:组分ARf=a/l;组分BRf=b/l

2.相对比移值,即相对某一物质XRf值,用Rx表示。其定义为:Rx=组分的Rf值/物质xRf值,组分A相对于物质B相对比移值” RB =a/b


三、薄层色谱的操作

包括:吸附剂的选择、薄层板的制作、展开剂的选择、点样、展开、定位于显色、薄层层析的定量。

    1.吸附剂的选择:

   常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺等。首先决定于样品成分的性质,即它们的溶解性、酸碱性、极性以及是否与吸附剂起化学反应等;其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其价格等。

    2.薄层板的制作:

   层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂(纸浆、纤维素、硅胶、中性氧化物、聚酰胺、多孔性玻璃粉,硅烷化键合硅胶等)均匀地涂在在薄层板(玻璃板、金属板或弹性塑料板)上,干燥(110℃活化)后即可使用。

    3.薄层层析中展开剂的选择:

    1)主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。各种展开剂按其极性不同排序为:烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<酯类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类<酚类<羧酸

    2)薄层条件的选择,如图是Stahl设计的用以选择薄层条件的简图,(1)为被分离化合物的极性(2)为吸附剂的活度(3)为展开剂的极性。若将这三个因素各自固定在圆周的三分之一,转动圆盘正中的三角形,如果角A指向极性物质,则角B指向活度小的吸附剂,角C就指向选用极性展开剂;如转到A’B’C’处则又要作另外的选择组合。

    3)在具体工作中,展开剂的选择还必须进一步通过实践,一般可用下列三种方法:

    (1)查阅文献;

    (2)微型薄层:用小玻片铺上薄层,用各种经初步选择认为可能应用的展开剂展开,从而选择适当的展开剂,再用于一般的薄层层析。用微型薄层,节省材料和时间;

    (3)微量圆环技术。

    

    4)点样

   (1)样品溶液一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机溶剂,最好用与展开剂极性相似的溶剂溶解试样,配成0.5%~1%的试液。

    (2)点样量:点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的灵敏度有关。一般来说,样品量最小为几ng,常用量为几至几十µg,制备型的分离可以点样到mg量。总之点样量随分离目的而定。

    (3)点样方式:最好是直径3—5mm的圆点。常用点样方式包括a.一般点样,b.径向点样,c.条状点样,d.线形小孔点样,e.样品填入沟槽。

    (4)点样容器:定容毛细管、微量注射器、点样器。

   

     5)展开:

   (1)展开操作a.展开槽的密闭,目的是使展开槽被展开剂蒸气饱和并使展开剂组成不变。b.展开槽的饱和,为避免边缘效应,在薄层板用展开剂蒸气饱和有时是必要的。c.展开距离,常规薄层最长展距为20cm;高效薄层展距最长为10cm

    (2)水蒸气的影响,在吸附薄层色谱的展开过程中,空气的相对湿度以及展开槽中的水蒸气必须严格控制,微量的水也能对色谱分离结果产生较大的影响。硅胶薄层板吸附水蒸气的速度很快,0.25mm厚、20×20cm的薄层板在50%相对湿度中约3分钟就失去活性的一半,而15分钟时吸附的水分已达到最大值,因此,点样速度的快慢,空气相对湿度的大小,都可以影响分离以及重现性。适宜的相对湿度范围也决定于溶质和溶剂的极性。

    (3)溶剂蒸汽的影响:边缘效应Stahl在用氯仿-甲醇(955)为展开剂展开麦角生物碱时发现,对同一种生物碱,在薄层板中部的Rf值比在边缘的Rf值小,称此现象为边缘效应edge effect)。展开槽中被展开剂蒸气饱和后再进行展开就可以消除。如图所示,在未饱和展开草中薄层板上出现的边缘效应

    

 4.展开槽:常用的就是普通展开槽、双底展开槽、水平展开槽。

    5.展开方式:

    1)近水平展开:将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.5cm,薄层上端垫高使薄层与水平成5-10º的角。

    2)上行展开:将点样后的薄层放在盛有展开剂的直立型的展开槽中,展开剂由薄层下端借毛细管作用上升至前沿。

    3)下行展开

    4)双向展开


    6.薄层层析的定性检测:展开完毕后,把薄层从层析缸中取出,用铅笔划出或小针刺出展开剂前缘的位置,随即进行显色,以确定各个斑点的位置、Rf值和显色情况,从而判断试样中含有哪些组分。有色物质经展开后呈现明显的色斑,很易判断。对于无色物质,可根据化合物的性质,用物理检出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射性检出法进行显色。

    1)物理检出法:紫外光、碘、水

    2)化学检出法:化学检出法是在薄层上使用一种或数种化学试剂与被检出物质反应,生成有颜色的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。显色剂一般分为两类,即通用显色剂和专属性显色剂

     (1)通用显色剂:a.浓硫酸或50%的硫酸溶液:极大多数有机物质,喷此种显色剂后立刻或在加热到110—120并经数分钟后出现棕色到黑色斑点。b.酸碱指示剂溶液:例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液,在绿色背景上显现黄色斑,表示是脂肪族羧酸。常用的通用显色剂还有:5%磷钼酸乙醇、碱性高锰酸钾溶液、硝酸银-氢氧化铵试剂、荧光显色剂等。

      (2)专属性显色剂,指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。例如2%24-二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120加热10分钟,醛酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑。

    3)原位化学衍生化

    4)生物与酶检出法

    5)放射显影法


    7.薄层层析的定量测定:

    1)直接测定法:色谱分离后,直接用肉眼观察比较或用仪器扫描斑点而测定其含量。

    a.目测法样品经色谱分离后,直接观察所得斑点的大小和颜色的深浅,并与标准品在相同条件下展开所得到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较,而近似地判断样品中所测成分的含量。

    b.测面积法展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间,符合一定的线性关系。

    c.仪器测定法:用光密度计或称薄层扫描仪TLC Scanner)扫描定量,该方法已成为薄层定量的主要方法。主要包括:吸收测定法,荧光测定法,荧光淬灭法。

    2)洗脱测定法:

    (1)斑点的定位

    (2)斑点的洗脱:用吸集器将斑点位置的吸附吸下,然后用洗脱溶剂洗脱。

    (3)测定:

    a.紫外分光光度法:洗脱液调整至一定体积,在此化合物最大吸收波长处测定。同时把样品斑点相应位置薄层吸附剂同样取下做空白对照。  

    b.比色法:选择灵敏度高、专属性好的比色反应测定化合物含量,是比较常用的方法。

    c.其它方法:极谱、库仑滴定、荧光测定等。


四、特殊的薄层

    1.高效薄层色谱(HPTLC):是在普通薄层基础上发展起来的一种更为灵敏、精细的薄层技术。高效薄层是采用小颗粒吸附剂制备的均匀薄层,分离效率比普通薄层提高三倍,检出灵敏度增加,分析时间缩短。

    2.棒状薄层色谱(Rod-TLC):将样品点在薄层棒上,经点样、展开后将被分离后的色谱棒通过适当的机械传动装置,水平地穿过检测氢火焰的中心,使化合物燃烧裂解,形成离子碎片和自由电子,再由电极收集它们并产生与化合物量成正比的电流信号而测出各物质的含量

    3.超薄层色谱(Ultra Thin-layerChromatography):经四氯烷基硅(键合铅)制成整块硅胶板,而不用颗粒状吸附剂。厚度10µm,有孔径为1~2µm的大孔,孔径为3~4nm的中孔。UTLC取代了玻璃板,不需要载体;展程1~3cm,缩短分析时间,节约展开剂;具有高分离效率和选择性。可用于分离药物、酚类、增塑剂、甾族化合物等


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