刘硕β-兴奋剂在动物性食品中残留的免疫分析方法研究进展

食品与发酵工业杂志 2019-07-06 11:10:28

β-兴奋剂在动物性食品中残留的免疫分析方法研究进展

刘硕, 陶晓奇

西南大学食品科学学院


β-兴奋剂,又称为β-肾上腺素受体兴奋剂,是一组结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类衍生物,用于哮喘和产后疼痛的临床治疗[1],同时能够通过刺激β-肾上腺素受体促进蛋白质合成,增加肌肉生长和减少脂肪沉积[2]。根据苯环上取代基的不同分为苯胺型、苯酚型以及苯二酚型三大类,常见有克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、溴布特罗等。

然而,若动物摄入β-兴奋剂且残留于动物体内的药物通过食物链进入人体中,轻则引起心悸、头疼、目眩、恶心,重则对肝、肾等内脏器官产生毒副作用[3]。目前,欧盟已禁止在畜牧业中使用此类药物[4],我国农业部235号文件规定:克伦特罗、沙丁胺醇、西马特罗及其盐、酯在所有食品动物及所有可食组织中禁止使用,并且不得检出[5]

免疫分析法(immunoassays,IAS)是以抗原抗体特异性结合为基础的分析方法。本文主要对各种免疫分析法在β-兴奋剂类兽药残留检测中的应用进展进行综述。

1 放射免疫分析

放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)是利用同位素标记的与未标记的抗原(抗体)同抗体(抗原)发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法,最早由美国科学家YALOW和BERSON[6]利用131I标记的胰岛素与血浆中的胰岛素竞争有限的抗体。GRANJA等[7]对于β-兴奋剂(克伦特罗,马布特罗,溴布特罗,西马特罗,辛可特罗)的多残留筛选方法和在牛肝脏中沙丁胺醇的多残基筛选方法进行了验证研究,8种目标化合物的检测能力值为0.25~0.5 g/kg。该法灵敏度达10-12~10-13 mol/L、特异性强、精确度佳且样品用量少,但放射性核素对人体存在一定的危害,限制其在农兽药残留分析中的应用,甚至趋向于被淘汰。

2 荧光免疫分析

荧光免疫分析(fluorescent immunoassay,FIA)是以荧光物质标记抗原或抗体作为示踪物的一种免疫测定方法,分为荧光偏振免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、量子点荧光免疫分析、荧光猝灭免疫分析和荧光增强免疫分析等几类:

1.1 荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassayFPIA)

荧光偏振免疫分析采用均相反应模式,是一种基于荧光偏振和免疫竞争原理的定量免疫分析技术,游离的药物分子体积小,受到偏振光照射后产生荧光的偏振方向被分散,而小分子药物与抗体结合后,增大了分子体积,受到偏振光照射后能产生偏振光,且随着浓度的增大而增大[8]。袁利鹏等[9]将沙丁胺醇半琥珀酸与异硫氢酸荧光素己二胺衍生物反应合成荧光示踪物SAL-HDF,利用荧光偏振免疫分析法检测沙丁胺醇,通过优化示踪物和抗体的最适工作质量浓度,结果表明,该法的LOD值为72.36 ng/mL,IC50为975.18 ng/mL,检测范围为178.08~4 871.15 ng/mL,平均回收率为(99.91±2.60)%,变异系数为2.60%。FPIA的优点为在实验过程中不需要分离,反应仅需要几秒钟到几分钟。同时,FP是一个比值,不会受到溶液颜色转变及仪器灵敏度的影响。因此,FPIA的检测结果稳定、重现性好,近年来在兽药残留检测中的应用日趋广泛,但这种方法,灵敏度比ELISA低,检测限一般在0.1~10 ng之间,检测过程中容易受到光散射和样本基质的影响[10]

1.2 时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassayTRFIA)

该法为消除生物材料中的背景干扰,根据背景具有荧光衰变期短的特点,利用长寿命的荧光物质进行标记,当寿命较短的生物材料背景荧光完全衰减后再进行检测以此消除本底的干扰,采用镧系元素作标记物,可保存1~2年,灵敏度达到RIA水平。侯文慧[11]用铕标记时间分辨荧光免疫法检测沙丁胺醇,IC50为1.6 ng/mL,检测范围为0.39 ng/mL~12.77 ng/mL,LOD值为0.136 ng/mL,其特异选择性高,与克伦特罗的交叉率较小(2.29%),而与莱克多巴胺没有交叉,在猪肉、猪肝、猪尿、饲料4 种基质的平均加标回收率分别为98.02%、96.03%、108.73%、 106.09%。

1.3 荧光猝灭免疫分析(fluorescence quenching immunoassayFQIA)和荧光增强免疫分析(fluorescence enhancedimmunoassayFEIA)

荧光淬灭免疫分析法的原理是当荧光标记物与抗体结合发生荧光淬灭,荧光增强免疫分析法的原理是荧光标记物与抗体结合后荧光强度增强。史聪颖等[12]建立高灵敏度的荧光猝灭试纸条技术用于检测猪尿、猪肉中莱克多巴胺,灵敏度为0.16 ng/mL,检测范围为0.16~20 ng/mL。该方法回收率为97.2%~106.1%,最大相对标准偏差为3.84%(批内);对于批间重现性实验,回收率为89.0%~109.1%,最大相对标准偏差为6.34%。ZHANG等[13]采用以胶体金为基础的荧光猝灭免疫层析分析法测定样品中的β-兴奋剂,当抗体量为0.8 μg/mL,检测时间为15 min时,免疫层析测试条的LOD值为0.12 ng/mL,可同时测定五种β-兴奋剂,当通过该法测试加标的猪尿液样品(5.0 ng/mL和10.0 ng/mL)时,回收率分别为(39.00±3.0)%和(32.00±2.0)%。

1.4 量子点荧光免疫分析

量子点荧光强度比传统有机荧光强度高100倍,具有狭窄的荧光发射光谱和较大的Stokes位移。以量子点作为荧光标记的探针开发的荧光免疫分析方法,能够大幅度的提高农兽药残留的检测灵敏度[14]。WANG等[15]用量子点荧光免疫分析法对样品中的莱克多巴胺进行测定,结果表明,荧光免疫法LOD值为1 ng/mL,分析时间为4 h,适合痕量检测。ZHOU等[16]制备超稳定水溶性CdSe / ZnS量子点(QDs)作为荧光标签,用竞争性侧流免疫(LFIA)生物传感器系统检测莱克多巴胺在猪尿液中的残留,其可靠检测限被成功地减至0.1 ng/mL,这比商业RAC侧流免疫分析带高了30多倍。

传统荧光物质干扰性大、灵敏度低。荧光偏振免疫测定法、时间分辨荧光免疫法及量子点荧光免疫法等的出现使得FIA的灵敏度得到了大幅度提升。FIA可进行全自动大批量检测,相信其在兽药残留检测中具有良好的应用前景[17]

3 酶免疫分析

酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)是20世纪70年代后迅速发展起来的非同位素免疫测定法,其原理是在抗体或抗原分子上标记特定的酶,根据抗原和抗体反应的特异性以及具有高效性的酶催化显色反应对一些超微量残留物进行检测[10]。根据其反应介质和步骤的不同分为非均相酶免疫分析和均相酶免疫分析2大类,后者大多用于治疗药物的检测,此处不作详细介绍:

非均相酶免疫分析即抗原、抗体反应在固液相间进行,反应平衡后进行两相分离,其典型代表是Engvall和Perlman创立的酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[18],用于兽药残留分析,分为抗体包被直接竞争ELISA、抗原包被直接竞争ELISA和间接竞争ELISA三种模式,此处主要介绍后2种:

3.1 抗原包被直接竞争ELISA(direct competitive ELISA with antigens coated on the solid phase)

将抗原包被到聚苯乙烯96孔板上,加入待测物和酶标记抗体竞争结合包被抗原,平衡后洗涤,加底物显色并检测。DU等[19]用抗原包被直接竞争ELISA法对组织和饲料样品中的残留溴布特罗进行测定,其IC50和LOD值分别为0.165 ng/mL和0.007 ng/mL,与克伦特罗,特布他林和西布特罗的交叉反应性小于6.2%,与9种其他化合物没有交叉反应性,对肝、肉和饲料样品加入不同浓度的溴布特罗并通过ELISA分析,其回收率为91.9%~115.4%,分析内变异系数为1.5%~9.5%(n= 3)。

3.2 间接竞争ELISA(indirect competitive ELISA)

间接竞争 ELISA与抗原包被直接竞争 ELISA竞争方式的相同,一抗与抗原结合后与二抗结合,显色的位点由一抗变成酶标记后的二抗。WANG等[20]建立了间接竞争ELISA测定猪肉样品中的苯乙醇胺A残留,其LOD值低于0.08 μg/kg,IC50值为0.93 pmol/mL(0.32 ng/mL),对一些其他β-兴奋剂显示出可忽略的交叉反应性。CAO等[21]建立了间接竞争ELISA检测组织和饲料样品中的苯乙醇胺A,试验结果显示IC50和LOD值分别为0.049 ng/mL和0.003 ng/mL,3种常用的β-兴奋剂(克伦特罗,沙丁胺醇和莱克多巴胺)的抗血清的交叉反应性小于0.39%,与其他6种化合物没有交叉反应性,对猪肾、肝、肉和饲料样品用不同含量的苯乙醇胺A强化,并通过ELISA分析,其回收率为92.2%~113.7%,分析内变异系数为3.8%~10.9%(n= 3)。

近年来,各专业性公司在ELISA 的缓冲液系统、反应条件以及包被抗原、特异性抗体、显色系统制备、酶等方面取得了突破性的进展,使得商业化 ELISA 试剂盒在灵敏度、精密度、稳定性等方面均达到了动物性食品中药物残留检测的要求。同时,ELISA方法具有仪器化程度较低、操作简便和成本适中等优点,ELISA试剂盒已成为目前食品安全中药残留检测的主流技术[22]

EIA使用酶标记,避免了RIA的放射性污染,操作方便,灵敏度可达10-10~10-11 mol/L。但仍存在不足之处,如ELISA法是固相免疫反应,抗原抗体完全反应需要1~2 h,实际操作中,需要经洗涤分离结合的和未结合的抗体,操作过程难以完全自动化。

4 化学发光免疫分析

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)化学发光法和免疫分析法两者的特点以发光物质或酶来标记抗原或抗体,标记的抗原或抗体与待测物反应后经过理化处理(如洗涤和离心分离等步骤)加入酶底物或氧化剂而发光,通过测量化学发光强度,绘制标准曲线测定待测物的含量。根据化学发光免疫分析体所选标记物的不同,将化学发光免疫分析方法分为以下三大类:

4.1 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassayCLIA)

化学发光免疫分析是化学发光试剂直接标记抗体或抗原的一种免疫测定方法。目前使用最多的是鲁米诺类和吖啶酯类这两类物质[23]。GAO等[24]通过利用莱克多巴胺和沙丁胺醇作为模型,提出了用于β-兴奋剂的快速和多重测定的新的免疫层析分析法,引入了化学发光方法,所提出的方案显示出更高的灵敏度,在最佳条件下,可以在0.50~40 ng/mL和0.10~50 ng/mL的线性范围内分别检测到莱克多巴胺和沙丁胺醇,LOD值分别为0.20 ng/mL和0.040 ng/mL。

4.2 化学发光酶免疫分析(chemiluminescence enzyme immunoassayCLEIA)

CLEISA检测原理与ELISA法基本相同,不同的是用化学发光剂代替显色剂作为酶的底物。目前常用的标记酶是辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)。WU等[25]合成沙丁胺醇-牛血清白蛋白和沙丁胺醇-卵白蛋白包被抗原,并用免疫原处理6只新西兰白兔以获得多克隆抗体,以开发快速、灵敏的间接化学发光酶免疫测定(CICLEIA)用于分析样品中的β-兴奋剂,在优化条件下,沙丁胺醇的线性动态范围和LOD值分别为0.007~0.17 μg/L和0.003 μg/L,相关系数为0.996 5,最大抑制浓度为0.028 μg/L,沙丁胺醇、克伦特罗和溴布特罗的回收率分别为78.8%至119.0%。基于时间分辨可以同时检测两种兽药,WANG等[26]以莱克多巴胺和克伦特罗作为目标药物,开发了基于时间分辨化学发光策略的新型多重免疫层析测定用于β-激动剂的定量检测,莱克多巴胺和克伦特罗的LOD值分别为0.17 ng/mL和0.067 ng/mL(S/N=3),整个反应可以在20 min内完成。

4.3 电化学发光免疫分析(electrochemiluminescence immunoassayECLIA)

电化学发光免疫分析是将电化学发光、免疫分析和化学分析相结合的一类化学发光免疫分析方法,是由电化学反应引起的化学发光过程。DONG[27]基于金纳米粒子和L-半胱氨酸封端的CdSe量子点设计电化学发光免疫传感器的信号放大策略,用于在K2S2O8作为共反应物的情况下高度灵敏地检测溴布特罗,在最佳条件下,该法具有0.01~1 000 ng/mL的良好线性范围和0.003 ng/mL的较低LOD值,还研究了该法的特异性和稳定性,其已经用于在实际样品中测定溴布特罗,具有令人满意的结果。CAI等[28]建立了一种超灵敏的新型电化学免疫传感器用于沙丁胺醇的检测,使用量子点和金纳米粒子结合HRP作为电化学发光信号,LOD值为0.017 ng/mL,该法灵敏度高,重现性和选择性好。

近年来,各种分离技术与CLIA的联用,如流动注射化学发光免疫分析(FI-CLIA)徐明霞等[29]构建了一种酶放大的流动注射化学发光免疫传感器分别向猪肉、猪肝样品中加入0.5、5、20 ng/mL的沙丁胺醇标准溶液进行测定,回收率为88.6%~120.0%,相对标准偏差在9.0%以内。由于新的标记技术和发光标记物的出现,CLIA的灵敏度显著提高,极大地促进了CLIA应用研究的发展[22]。基于磁性微粒子和金纳米粒子的化学发光免疫分析的研究越来越多,在快速分离与提高灵敏度上取得突破性的进展[30]

5 胶体金标记免疫分析

胶体金标记免疫分析(colloidal gold immunoassay,CGIA)采用纳米金颗粒标记抗体,当被标记的抗体聚集达到一定程度时,出现肉眼可见的紫红色,从而实现了对抗体和抗原反应结果的测定。LIU等[31]利用纳米胶体金免疫层析试纸条检测肉类样品中的沙丁胺醇,LOD值是5.0 μg/kg,灵敏度较高。WU等[32]基于胶体金纳米粒子的免疫层析测定法结合磁性固相萃取法用于猪肉中克伦特罗残留的定量检测,检测限和定量限分别为0.10 ng/g和0.24 ng/g。由于胶体金本身具有颜色,与ELISA相比省去了显色和终止的步骤,大大简化了操作[33]。CGIA操作简单、快捷迅速、安全简便且不需任何设备和仪器。但是由于基质干扰易出现假阳性和假阴性结果,一般只能完成定性或半定量检测,不能达到准确的定量检测[34],实现检测试纸的定量、高灵敏度和多元检测成为胶体金免疫层析技术重要的发展方向。

6 免疫芯片

免疫芯片探针(根据不同的研究目的选用抗原、抗体、受体等不同的具有生物活性的蛋白质)高密度固定于芯片上,通过特异性免疫反应捕获样品中的目标物[35]。SUHERMAN[36]等使用装配有一种制备免疫传感器芯片的表面等离子体共振传感器检测克伦特罗,用于制造免疫表面的最低浓度的二硫双(琥珀酰亚胺基)丙酸酯(DSP)溶液(0.1 mmol/L)对于克伦特罗显示出3 ppt的检测灵敏度,是报道过的最高灵敏度。ZHENG等[37]为了方便在表面增强拉曼光谱(SERS)免疫分析中更易处理样品,使用了3D芯片,制造了芯片上多层微流体纸基分析装置,以向操作者提供关于不同微流体之间的相互作用的手动开关,对盐酸克伦特罗定量检测,LOD值为0.1 pg/mL。这种方法具有高通量、自动化、灵敏度高等其他方法所没有的优势。近年来,我国在免疫芯片技术领域取得了突破性的进步,已广泛应用于食品安全检测,具有越来越广阔的应用前景。

7 免疫传感器

免疫传感器是生物传感器的一种,是传感器的感受器与样品中的目标物之间发生抗原抗体的识别作用,进而产生一些物理化学变化,这些变化通过不同原理的换能器转换成电信号或其他形式的信息输出并记录。WEI等[38]研究用由表面被L-半胱氨酸和戊二醛修饰的丝网印刷金电极(SPGE)构成的便携式无标签免疫阻抗免疫传感器检测克伦特罗,在优化的条件下,免疫传感器可以检测到1.0×10-4~1.0 mg/L(R=0.998)范围内的克伦特罗,LOD值为2.0×10-5 mg/L,加标猪肉样品的平均回收率为92.4%~104.6%,相对标准偏差为3.6%~5.2%。ZHANG等[39]将由硫化锌量子点和聚苯胺(ZnSQD @ PANI)组成的纳米复合物与抗克伦特罗的抗体一起置于金电极上,得到检测克伦特罗的电流型免疫传感器,当在0.21 V(相对于Ag / AgCl)的工作电位下操作时,免疫传感器显示出低至5.5 pg/mL的LOD值,并且在0.01~10 ng/mL的浓度范围内工作,与使用原始PANI相比,用ZnSQD @ PANI纳米复合材料改性的电极吸收克伦特罗抗体更好,因此对克伦特罗显示出更高的敏感性。免疫传感器专一性强,便携性好,且由于其具有高度的自动化、微型化和集成化,减少了对环境技术条件和使用者的依赖性。

8 流动注射免疫分析

流动注射免疫分析(flow injection chemiluminescence immunoassay,FIIA):有两大类型:均相流动注射免疫分析和非均相流动注射免疫分析。在兽药残留检测中常将化学发光免疫分析与流动注射联用,SONG等[40]用流注射化学发光免疫分析法检测样品中的克伦特罗,使用竞争性免疫测定形式,化学发光强度的降低与在0.40~120 ng/mL范围内的克伦特罗浓度的增加成比例,相关系数为0.999(n=9),LOD值为0.20 ng/mL。XU等[41]用流动注射-化学发光免疫分析方法测定食品中的沙丁胺醇,其LOD值为0.15 ng/mL,该方法具有良好的稳定性、特异性和重复性,应用于实际样品,结果令人满意。FIIA可以大大缩短测定时间,节约免疫试剂,并且方便自动化。

9 免疫PCR

免疫PCR(immuno-PCR,IPCR)1992年SANO等[42]将ELISA和PCR技术结合在一起建立了一种新型的检测技术即IPCR。戴明雁[43]在酶联免疫方法的基础上,用荧光定量PCR作为信号检测手段,建立实时定量IPCR法检测莱克多巴胺。该方法的LOD值为0.003 9 ng/mL,IC50=0.18 ng/mL,与ELISA方法相比,灵敏度提高了2个数量级,在莱克多巴胺浓度为0.25~1.0 ng/mL时,板内回收率在80%~120%,板内及板间变异系数小于10%。LEI[44]等研究一种新的以预组装DNA免疫探针为基础的IPCR方法检测样品中的沙丁胺醇,在优化条件下,检测结果显示线性范围超过7个数量级,在标准缓冲液中沙丁胺醇的检测限为21 fg/mL,与使用相同抗体的直接竞争性ELISA相比,灵敏度提高300倍。IPCR技术应用对象广泛,大大提高了检测的灵敏度和准确度,因此在兽药残留检测中将会有更深入的研究。

10 其他免疫方法

近年来科研工作者不断研究开发新的免疫分析方法检测食品中β-兴奋剂残留,CHENG等[45]将聚集的氧化石墨烯/金纳米颗粒杂化物的SERS与免疫磁珠样品制备方法结合,开发了确定动物尿中克伦特罗含量的高灵敏度方法,检测时间仅需15 min/样品,尿液中的检测限和定量限分别为0.5 ng/mL和1 ng/mL,回收率为82.8%~92.4%,变异系数小于9.4%,检测的日常变化小于6.41%。WANG等[46]开发了基于上转换荧光体(UCP)用于定量检测克伦特罗的新型的、超灵敏的免疫层析测定传感器,感应结果可在10 min内获得,在优化的条件下,该传感器对克伦特罗的视觉检测限(VLOD)为0.1 ng/mL,使用该传感器可以实现低至0.01 ng/mL的克伦特罗的计算检出限(CLOD)。各种样品基质中克伦特罗的回收率为73.0%~92.2%,相对标准偏差低于12%。

11 多组分残留

近年来人们更趋向于研究将检测范围由单一检测转向多残留检测,多残留检测既指同时检测一类兽药中的几种,又指同时检测几类兽药,上文已涉及几种多残留检测的方法,如:以时间分辨为基础的化学发光免疫法等。除此之外还有一些其他免疫分析方法,WANG等[47]开发了一种灵敏的、定量的荧光多组分免疫色谱传感器用于检测克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇3种β-兴奋剂残留,反应时间仅为10 min,克伦特罗,莱克多巴胺和沙丁胺醇的LOD值分别为0.10、0.10和0.09 ng/mL,回收率范围为70.0%~100.5%,相对标准偏差低于15%。HAN等[48]开发多重浸渍免疫测定法同时测定牛奶,尿液和血清中的多种兽药残留,如β-兴奋剂,磺胺类药物和四环素,样品不需要预处理并且可以在10 min内直接分析,肉眼估计不同样品基质中克伦特罗、磺胺嘧啶和四环素的阈值水平分别为0.3~0.45 ng/mL、3~4 ng/mL和4.5~6 ng/mL,加标样品中克伦特罗,磺胺嘧啶和四环素的回收率为78.4%~112.6%,相对标准偏差低于11.2%。

12 结语

尽管自“瘦肉精事件”后,国家对β-兴奋剂类兽药残留加大了监管力度,检测方法也有了突破性进展,但非法使用的现象还时有发生,由于免疫分析技术仍存在一定的问题和局限,尚待进一步发展和完善,所以将其应用于β-兴奋剂类兽药残留的检测仍须科研人员的不懈努力。食品是一个复杂的体系,小分子药物也具有多样性,检测时需要多种技术的联合使用,取长补短,获得单一分析技术难以达到的效果,追求更高的检测通量、灵敏度、特异性和更低的检测限。在科研人员的共同努力下,免疫分析法会在β-兴奋剂类药物残留检测中发挥更大的应用价值,为保障动物性食品安全全做出更大的贡献。

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Immunoassays for determination of β-agonists residuesinanimal-derived food

LIU Shuo,TAO Xiao-qi*

(College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China)

ABSTRACT The beta-agonists can reduce animals’ fat content,promote protein synthesis,improve the ratio of lean muscle and increase feed efficiency.Hence,it is often used as a feed additive.However,because the beta-agonists residues can still remain in animal tissues,it causes heart palpitations,headaches,liver and kidney poisoning and other serious harm to human being.Most countries including China,have banned the use of beta-agonists in animal products.Nowadays,the various detection methods of beta-agonists residues in animal-derived food have been reported.This paper mainly introduces the principles,advantages and disadvantages,the research progress and development trend of immunoassay methods,including radioimmunoassay,enzyme immunoassay,chemiluminescence immunoassay,fluorescent immunoassay,colloidal gold immunoassay,immunosensor,immunochip,flow injection chemiluminescence immunoassay and immuno-PCR. This article provides a reference for the fatrge development.

Key words β-agonists; immunoassay; animal-derived food


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